YAP/TAZ Are Mechanoregulators of TGF-b-SmadSignaling and Renal Fibrogenesis

J Am Soc Nephrol. 2016 Oct;27(10):3117-3128

原文链接：https://jasn.asnjournals.org/content/27/10/3117

一、研究背景

肾纤维化的发生，多具有一个关键但未被充分认识的变化，就是机械调节。多种因素导致器官损伤，组织修复后产生瘢痕，伴随着细胞间胶原蛋白的沉积，进而使组织刚度增加，产生“机械信号”。反复的损伤，过度的修复，这种失衡最终导致肾纤维化。

已经可以明确的是，在纤维化的进程中，成纤维细胞的活化可导致细胞外基质的沉积，TGF-β是驱动这一过程的“钥匙”。TGF-β使细胞内促纤维化转录因子Smad2和Smad3的C末端磷酸化，磷酸化的Smad2/Smad3聚集在细胞核中，驱动促纤维化基因的表达。YAP/TAZ是通过在细胞核中保留活化的Smad2/3来促进TGF-β信号传导的转录辅因子，同时它们也是机械信号的敏感蛋白。

因此，作者认为YAP和TAZ可能是关键的机械转导，将细胞外基质沉积的僵硬感与肾纤维化中TGF-β反应的调节联系起来。通过实验证明，硬基质环境下TGF-β诱导的成纤维细胞的Smad信号传导过程强于软基质环境，这种区别由YAP/TAZ介导。体内实验证明该过程的同时发现眼科用药维替泊芬可通过这一机制治疗肾纤维化，确定了一种有前景的肾纤维化新治疗策略。

二、结果

Result 1 TGF-β诱导的Smad信号传导受到细胞外基质硬度的调节

作者利用纤连蛋白包被的软(2kPa)或硬(100kPa)基质上培养的成纤维细胞，检测了细胞外基质硬度的差异对Smad通路中不同事件的影响。结果显示，TGF-β在不同硬度下均可以引起稳定的Smad2和Smad3的磷酸化。不同的是，在硬基质环境中，TGF-β诱导的成纤维细胞显示出强烈的Smad2/Smad3的核聚集（图A）；软基质环境下，TGF-β诱导的成纤维细胞Smad转录活性明显降低（图B）。二者合计，成纤维细胞内Smad2/Smad3的定位与下游转录活性的调节均受到机械性影响。

Result 2 YAP/TAZ在成纤维细胞中的定位是由机械调节

YAP/TAZ对机械信号敏感，是TGF-β诱导后与Smad2/3的定位相互作用的转录辅因子，这一特点在胚胎干细胞和上皮细胞中得到了证实。为了进一步明确成纤维细胞中机械信号对YAP/TAZ和Smad2/3的影响，作者在模拟正常肾脏(2kPa)和受损肾脏纤维化(100kPa)的力学机制环境中，对培养的肾成纤维细胞进行了YAP/TAZ免疫荧光染色，结果显示硬基质环境下YAP/TAZ具有强烈的核聚集（图A），确认了YAP/TAZ在成纤维细胞中的定位是由机械调节。

Result 3维替泊芬是通过下降YAP/TAZ的含量来抑制YAP/TAZ的作用

维替泊芬是YAP的抑制剂，但其是否还抑制YAP的同源物TAZ还未知。作者在明确机械信号对YAP/TAZ与TGF-β-Smad在成纤维细胞中的影响后，使用维替泊芬干预硬基质环境下培养的NRK49F细胞，同时分别设置了有无TGF-β的诱导。结果显示，TGF-β诱导下维替泊芬不会影响YAP/TAZ的核聚集（图A、B），但是会降低YAP/TAZ的合成而减少含量（图C、D、E），进而影响YAP/TAZ与其他蛋白结合的水平，包括Smad2/3与TMED1（另一种TAP/TAZ的结合伴侣）（图F）。

Result 4抑制YAP/TAZ的维替泊芬可以通过减少激活的Smad核积累和总体丰度来抑制TGF-β信号传导

在得到维替泊芬具有YAP/TAZ的抑制作用的结果后，作者研究了该药物对TGF-β诱导的Smad信号传导的影响。实验结果显示，维替泊芬并不能降低TGF-β诱导的Smad2和Smad3的磷酸化（图A）。和前期结果一致的是，因为维替泊芬对YAP/TAZ的抑制作用，TGF-β诱导的Smad核积累明显减少（图B）。更重要的发现在于，维替泊芬下降了细胞中Smad2和Smad3的含量（图C），其原因可能是维替泊芬在此情况下增强了活化的Smad2和Smad3的蛋白酶体降解（图D）。进一步，作者发现维替泊芬可以影响肾成纤维细胞TGF-β信号通路的后期阶段，包括Smad3转录活性（图E）和Smad可诱导基因的内源表达（图F），通过siRNA介导的YAP敲除证明了维替泊芬的Smad抑制作用至少部分是通过YAP介导的（图G）。

Result 5肾损伤引起的肾纤维化，维替泊芬可以降低体内YAP/TAZ

作者使用单侧输尿管梗阻手术复制小鼠肾纤维化模型，选择成纤维细胞标志物α-SMA为评价指标，分析小鼠体内YAP/TAZ的变化情况，获得结果与前期研究具有相关性。与正常假手术的肾脏相比，手术受伤的小鼠肾脏α-SMA+的成纤维细胞中出现YAP/TAZ核积累（图A、B、C）。维替泊芬干预后，小鼠的肾间质YAP/TAZ染色显著降低（图D）。此外，阻塞的肾脏的α-SMA+染色具有Smad2/3核积累显着增加的现象，当用维替泊芬降低YAP/TAZ水平时，这种现象没有出现（图E）。

Result 6体内实验证明维替泊芬抑制肾纤维化

鉴于维替泊芬能够下调小鼠受伤肾脏中的YAP/TAZ水平和Smad激活的能力，作者接下来测试了维替泊芬是否能阻止肾脏纤维化。实验结果表明，维替泊芬给药后（图A），小鼠肾组织α-SMA+肌成纤维细胞的数量下降（图B），胶原沉积减少（图C、D），并且减少了TGF-b/Smad的诱导基因CTGF（图E）。另一项实验表明，在手术造模后7天，肾纤维化开始发生，小鼠接受维替泊芬给药一周至14天时（图F），受损肾脏再次显示出较少的α-SMA+成纤维细胞（G），较少的纤维化（图H）和CTGF的表达（图I）。总体而言，维替泊芬不仅可以减少受伤肾脏的新生纤维生成，还可以防止已建立的纤维化进展。

三、小结与思考

作者通过体外实验证明，在肾成纤维细胞中，TGF-β信号通路中Smad信号传导受到机械信号影响，这一过程涉及到YAP/TAZ。进一步的实验，明确了YAP抑制剂药物维替泊芬可以下降YAP/TAZ的含量，减少活化Smad2/3的核定位，增强Smad2/3的蛋白酶体降解。同时，作者还发现维替泊芬对TGF-β信号通路后期的影响可能是通过YAP介导。体内实验结果与体外实验结果具有相关性，并且证明了维替泊芬不仅可以减少受伤肾脏的新生纤维生成，还可以防止已建立的纤维化进展。

近年来，对器官纤维化的研究不断深入，一些重要的机制不断被阐明。本文的亮点在于以肾纤维化进程中“机械信号”为切入点，挖掘出YAP/TAZ的重要地位，并且发现了已上市的眼科用药维替泊芬的新用途。这项研究无论是在肾纤维化甚至其他器官纤维化的疾病机制研究方面，还是在维替泊芬药物应用的新定位方面，都为研究人员提供了重要的参考依据。

文章YAP/TAZ Are Mechanoregulators of TGF-β-Smad Signaling and Renal Fibrogenesis于2016年2月发表在国际肾脏病权威期刊Journal of the American Society of Nephrology，影响因子8.547，通讯作者Darren A Yuen，单位Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael’s Hospital。

本文由2018级微生物与生化药学硕士研究生王栋供稿。