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    PD-1 up-regulation on CD4+ T cells promotes pulmonary fibrosis through STAT3-mediated IL-17A and TGF-β1 production
    发布者:2018级微生物与生化药学硕士研究生陈海红 来源:  日期:2020-03-12 14:16:50

    PD-1 up-regulation on CD4+T cells promotes pulmonary fibrosis through STAT3-mediated IL-17A and TGF-β1 production

    Science Translational Medicine 26 Sep 2018:Vol. 10, Issue 460

    原文链接:https://stm.sciencemag.org/content/10/460/eaar8356.short

    研究背景

    肺纤维化是指在抗原性和非抗原性来源持续刺激下结缔组织沉积导致的肺结构进行性重塑。尽管早期阶段的组织修复是有益的,但是持续的结缔组织沉积会导致瘢痕形成,最终导致肺纤维化。在肺纤维化中以特发性肺纤维化(IPF)的发病率最高,预后也最差。

    随着新疗法的不断涌现,加深了我们对肺纤维化的免疫学基础的了解,揭示了直接针对病理生理学的创新疗法。肺纤维化与多种细胞因子有关。例如,产生白细胞介素17A(IL-17A)在肺纤维化中发挥重要作用,在特发性肺纤维化患者的支气管肺泡灌洗液中IL­17A升高。在结节病性肺进展过程中,PD­1+ CD4+T细胞增加。

    作者对人和小鼠的标本进行了分子、免疫组化和流式细胞术分析。免疫组化显示淋巴细胞上PD-1表达上调。流式细胞术结果检测到增殖能力降低和TGF-β、IL-17A表达增加的PD-1+CD4+T细胞;PD-1+TH17细胞是表达TGF-β的主要CD4+T细胞亚群。分子分析显示PD-1对转录因子STAT3有调节作用。

    结果

    Result 1在正常组和IPF组中肺组织样品中的PD-1及血液样品中PD-1+CD4+T细胞表达差异的检测

    作者采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从健康对照组、结节病患者和IPF患者全血中分离外周血单个核细胞。利用流式细胞术分析正常组和IPF组中PD-1+CD4+T细胞表达差异。与健康对照组相比,IPF组中CD4 + T细胞上的PD-1表达明显更高。

    作者定义了IPF患者中CD4 + T细胞子集,该子集展示了PD 1+ T细胞的最高百分比。并在结节病患者中发现,TH17细胞占CD4+T细胞的最高比例。

    作者通过TCR刺激显示IPF患者中PD-1-CD4+T细胞的增值能力显著降低来证明了PD-1上调的功能意义。

    通过免疫组化对正常组和IPF组的肺组织样品PD-1表达进行分析,结果显示IPF组中PD-1及其配体PD-L1表达增加。

    Result 2IPF和结节病患者与正常组CD4+T细胞分泌TGF-β的差异鉴别,以及T细胞亚群TGF-β表达差异的鉴别。

    作者取结节病和IPF患者的CD4+T细胞进行细胞活性检测,结果显示与正常组相比,IPF组和结节病组TGF-β1和膜结合型TGF-β1表达明显升高。并用流式细胞术分析检测到PD-1在结节病和IPF患者中表达TGF-β1的CD4+T细胞上表达上调。

    由于促炎细胞因子IL-6调节TGF-β促进诱导Treg的发育,有利于TH17的发育。因此,作者检测了来自TH17细胞的LAP/TGF-β1分泌,与正常组相比,结节病和IPF患者的TH17细胞分泌的LAP/TGF-β1有显著增加;且LAP/TGF-β1频率和强度增加的结节病TH17细胞来源于基线PD-1MFI高的患者。与正常组相比,结节病和IPF表达TGF-β1的TH17细胞中PD-1的表达显著升高;

    与其他Treg细胞相比,在结节病和IPF患者中,TH17细胞分泌TGF-β1所占百分比最高。

    Result 3通过将人肺成纤维细胞和CD4+T细胞体外共培养检测胶原的生成,来鉴别阻断PD-1途径后是否能逆转结节病和IPF

    作者将正常组,结节病和IPF组的分离得到CD4 + T细胞,然后与人肺成纤维细胞共培养。采用流式细胞术分析检测到,与正常组相比,结节病或IPF的CD4 + T细胞和人肺成纤维细胞共培养产生的胶原蛋白1的百分比显着增加;并用酶联免疫吸附测定胶原1的生成证实了流式细胞术的结果。

    作者通过向从结节病和IPF分离得到的纯化CD4+T细胞加入αPD-1、αPD-L1和αPD-L2阻断抗体来阻断PD-1途径,和不加阻断剂进行对比培养过夜后给予TCR刺激,第二日,加入人肺成纤维细胞进行共培养,并用流式细胞术检测胶原的生成情况。PD-1途径阻断后,在结节病CD4 + T细胞存在下培养的HLF产生胶原蛋白1下降。IPF组和结节病有相似的效果。并使用抗COL1A1,抗平滑肌肌动蛋白(β-SMA)和纤连蛋白的抗体进行Western实验证实了这些结果。这些结果表明,PD-1 + CD4 + T细胞具有通过刺激HLF产生胶原1来诱导肺纤维化的能力。

    Result 4PD-1是否能够调节结节病和IPF患者中CD4+T细胞的TGFβ1IL-17A的表达进行研究

    为了了解PD-1如何通过HLF调节胶原蛋白1的产生,作者评估了器官纤维化的两个关键介质:IL-17A和TGF-β1。在PD-1途径阻断后,共培养实验中结节病产生IL-17A的CD4 + T细胞百分比下降PD-1途径的阻断显着减少结节病和IPF CD4 + T细胞中TGF-β1的分泌;并使用ELISA分析证实了上述结果。

    为了确定共培养实验中TGF-β1的来源,我们使用流式细胞仪评估了TH17细胞对TGF-β1的表达。PD-1途径阻断可有效降低结节病和IPF受试者中TH17细胞的TGF-β1分泌。

    Result 5PD-1途径阻断后降低CD4+T细胞中转录因子STAT3RORC的表达进行研究

    STAT3是TH17细胞发育的重要转录因子。为了确定PD-1调节IL-17A产生的分子机制,作者研究了STAT3的表达。定量PCR分析结果显示,与正常组相比,结节病和IPF组的STAT3基因表达明显升高;PD-1途径阻断后,STAT3基因表达明显降低。

    为了证实PD-1途径通过磷酸化STAT3(pSTAT3)介导IL-17A的产生调节胶原-1的产生,作者使用了pSTAT3的小分子抑制剂STATTIC进行验证。将从结节病患者中提取的CD4+T细胞给予STATTIC过夜处理后,与肺成纤维细胞共培养,结果表明,生成的胶原1明显减少。并且在结节病患者中,给予STATTIC后,产生IL-17A的CD4+T细胞显著减少。作者还对CD4 + T细胞中的RORC的表达进行了检测,与正常组相比,结节病和IPF患者的PD-1+FOXP3 +细胞的RORC表达显着增加。

    Result 6TH17相关通路基因的表达与IPF预期寿命的关系进行研究

    为了进一步评估间质性肺疾病与TH17细胞的相关性,作者从IPF患者中提取PBMC,以了解基因表达谱和临床结果的差异。结果显示,两个不同的TH17基因谱在无移植存活率(TFS)方面存在显著差异。IPF受试者中TFS增强,其遗传特征是TGF-β和IL-17A减少。在验证队列中观察到相似的结果,其中两组患者在总生存率上有显著差异。

    Result 7用博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型来研究肺纤维化与PD-1的关系

    为了评估PD-1+CD4+T细胞在其他机制诱导的肺纤维化中的存在,作者评估了小鼠在博莱霉素给药后肺中PD-1+CD4+T细胞的存在。博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠的单细胞肺悬液中的CD4+T细胞发现PD-1上调,并伴随着CD4+T细胞增殖减少。与PBS处理小鼠相比,博莱霉素诱导的小鼠的单细胞肺悬液中、TH17细胞分泌LAP/TGF-β1增加。

    为了确定阻断PD-1通路是否能抑制纤维化,作者用野生型和PD-1敲除C57BL/6小鼠经鼻给予博莱霉素诱导对照观察。与PD-1敲除小鼠相比,野生型小鼠的纤维化程度更高。

    同时,作者将博来霉素诱导小鼠进行抗PD-L1或同型对照治疗。结果显示,在接受抗PD-L1抗体治疗后的小鼠肺胶原含量较低。

    在博莱霉素治疗的小鼠中,PD-1表达与pSTAT3之间也存在显著相关性。

    总结与讨论

    为了确定胶原沉积前的免疫反应,作者对人和小鼠标本进行了分子、免疫组化和流式细胞术分析。首先利用流式细胞术分析发现在结节病和IPF受试者中PD-1+CD4+T细胞表达增加,免疫组化结果显示,PD-1表达增加;以TGFβ为检测指标,发现在结节病和肺纤维化患者中,TGFβ表达增加,在纤维化肺疾病患者中存在具有PD-1上调的分泌TGF-β的CD4+T细胞,且TH17细胞占分泌TGFβ占比最高的细胞;用人肺成纤维细胞和CD4+T细胞体外共培养检测来检测阻断PD-1途径后胶原的减少;利用体外共培养实验和流式细胞术分析检测到PD-1通过调节CD4+T细胞的TGFβ1和IL-17A的表达来促进肺纤维化的发生;证实PD-1途径通过磷酸化STAT3介导IL-17A的产生调节胶原-1的产生;TH17相关通路基因的表达与IPF预期寿命具有相关性;用博莱霉素诱导肺纤维化小鼠评估PD-1+CD4+T细胞在其他机制诱导的肺纤维化中的存在。

    本研究报告了PD-1对人TH17细胞的上调不仅创造了一个免疫抑制的微环境,而且也创造了一个有利的微环境。研究证明,PD-1+CD4+T细胞产生的IL-17A和TGF-β1诱导肺成纤维细胞产生胶原1,这一过程可被PD-1途径阻断所阻碍。PD-1通路阻断或STAT3小分子抑制导致肺成纤维细胞胶原生成减少。中医药具有增强机体免疫能力,提高抵御和祛除病邪的能力,多项临床和实验研究发现中医药在免疫器官、免疫细胞、免疫分子等方面调节肿瘤免疫功能。通过本研究的思路探讨中药复方治疗肺纤维化的机制具有重要意义。

    文章PD-1 up-regulation on CD4+T cells promotes pulmonary fibrosis through STAT3-mediated IL-17A and TGF-β1 production.于2018年9月发表在期刊SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE,影响因子7.21,通讯作者Lindsay J. Celada,单位Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TN 37232, USA.

    本文由2018级微生物与生化药学硕士研究生陈海红供稿。

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