卒中是一种由脑血栓形成或栓塞引起的急性脑血管疾病，包括出血性卒中和缺血性卒中。缺血性卒中是世界范围内最严重的疾病之一，严重危害人类健康和生命安全。它具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点。缺血性脑损伤一旦发生，其病理过程极其迅速。目前，及时消除血流是唯一的治疗策略，重组组织型纤溶酶原激活剂(r-tPA)是唯一获得美国食品和药物管理局(FDA)许可的治疗缺血性中风的药物。然而，缺血/再灌注(I/R)损伤可加重脑组织损伤，且r-tPA具有时间窗短、副作用大等局限性。神经炎症被认为是卒中进展的关键因素，但如何控制过度活跃的神经炎症仍然是一个长期存在的挑战。

2021年3月1日，中国药科大学庞涛研究员、上海交通大学张健教授、南京大学张存金团队在国际权威学术期刊《Acta Pharmaceutica Sinica B》发表了题为“A novel SIRT6 activator ameliorates neuroinflammation and ischemic brain injury via EZH2/FOXC1 axis”的文章设计了一种新型SIRT6激活剂MDL-811，MDL-811可能成为缺血性中风和其他与神经炎症相关的脑部疾病的替代治疗候选药物。

研究结果

1.MDL-811作为一种优越的SIRT6激活剂，在小胶质细胞/巨噬细胞中具有强大的抗炎作用

SIRT6在全身炎症的发病机制中起着重要作用，但SIRT6是否调节神经炎症仍然未知。作者团队发现MDL-800化合物是一流的小分子SIRT6激活剂，而MDL-811是一种改进的SIRT6激活剂。根据对接模型，MDL-811可以与Phe86形成氢键并参与与Phe86和V al153的疏水相互作用，变成SIRT6的结合位点。为了评估和比较两种SIRT6激活剂的抗炎作用，将不同浓度的MDL-800或MDL-811用于LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞系和原代小鼠小胶质细胞。MDL-800和MDL811剂量依赖性地减少了TNF-a的释放，而MDL-811比MDL-800具有更有效的抗炎作用。

图1发现MDL-811作为具有强大抗炎作用的优质SIRT6激活剂。

2.靶向SIRT6的MDL-811调节LPS刺激的原代小鼠小胶质细胞和RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

由于化合物MDL-811具有强大的抗炎作用，作者继续探索它是否与SIRT6激活有关。作者监测了用MDL-811处理后RAW264.7巨噬细胞系和原代小鼠小胶质细胞中的乙酰化H3K9 (H3K9Ac)和乙酰化H3K56 (H3K56Ac)蛋白水平。观察到在用MDL-811处理后，两种细胞中的H3K9Ac和H3K56Ac均呈时间依赖性降低，SIRT6没有明显变化，表明MDL-811可以通过使H3K9和H3K56去乙酰化来促进SIRT6活性。MDL-811不影响SIRT1底物H3K14Ac蛋白水平，表明MDL-811特异性激活两种细胞中的SIRT6。抗炎作用被SIRT6沉默与Sirt6 siRNA减弱，表明MDL-811抗炎作用是通过SIRT6介导的。

图2 MDL-811通过SIRT6激活减少巨噬细胞和小胶质细胞的炎症反应。

3.FOXC1参与MDL-811的抗炎作用

为了进一步阐明MDL-811抗炎作用的潜在机制，作者分析了MDL-811处理/未处理的RAW264.7细胞的转录组，然后使用RNA-seq进行LPS刺激。GO富集分析和KEGG富集分析发现许多可区分的基因模式与炎症相关。MDL-811剂量依赖性和时间依赖性增加了RA W264.7和原代小鼠小胶质细胞中Foxc1的基因表达。FOXC1敲低显着逆转了MDL-811对LPS诱导的TNF-a释放的抑制以及包括Tnf-a、Il-1b和Nos2在内的促炎因子的基因表达，并显着减弱抗炎因子的基因表达，包括RA W264.7巨噬细胞和原代小鼠小胶质细胞中的CD206。

图3转录组学揭示Foxc1基因参与MDL-811抗炎作用。

4.SIRT6介导的EZH2去乙酰化参与MDL811抗炎作用

SIRT6是一种脱乙酰酶，通过与各种转录因子相互作用来调节其靶基因的转录。越来越多的研究发现，EZH2的乙酰化增强了其调节FOXC1的能力。MDL-811是否可以在现有的实验条件下调节EZH2乙酰化，作者通过免疫沉淀评估了乙酰化EZH2的水平。在用MDL-811处理的细胞中，EZH2的乙酰化降低，这被Sirt6基因沉默阻断。为了确定EZH2是否被SIRT6去乙酰化，作者还研究了SIRT6和EZH2之间的相互作用，表明SIRT6和EZH2之间存在直接相互作用。然而，这些相互作用因SIRT6敲低而减轻，表明EZH2可作为SIRT6的直接底物。ChIP测定EZH2在Foxc1启动子转录起始P1区的结合明显增加。上述结果在原代小鼠小胶质细胞中得到验证。

图4 SIRT6促进的EZH2去乙酰化和FOXC1表达是MDL-811抗炎作用的核心。

5.MDL-811治疗可改善LPS诱导的神经炎症小鼠的神经行为缺陷

鉴于SIRT6激活剂MDL-811在体外具有强大的抗炎作用，作者建立了LPS诱导的神经炎症小鼠模型，以评估MDL-811在体内的抗炎作用。表明MDL-811改善了LPS诱导的神经炎症小鼠的疾病行为，MDL-811治疗显着减少了促炎性小胶质细胞/巨噬细胞数量，显着降低了LPS诱导的TNF-α 释放，降低了促炎因子的基因表达；SIRT6减少，其底物H3K9Ac和H3K56Ac在小鼠大脑皮层均增加。这些结果表明MDL-811激活SIRT6以减少LPS诱导的神经炎症小鼠的神经炎症并改善疾病行为。

图5 SIRT6激活剂MDL-811有效改善LPS诱导的神经炎症小鼠模型中的脑部炎症。

6.MDL-811治疗可减少tMCAO小鼠的脑损伤并改善神经行为缺陷

作者评估MDL-811在接受tMCAO的小鼠中的神经保护作用，评估了梗塞面积，MDL-811显着减少了tMCAO后3天测量的梗塞面积；MDL-811 (10 mg/kg)处理的小鼠显示出更少的IBA1+ CD16+小胶质细胞/巨噬细胞，显示出更小的细胞体和更薄的突起；在缺血/再灌注后第3天检测了脑皮质梗死周围区促炎因子和抗炎因子的基因表达。与载体组相比，MDL-811显着降低了促炎因子的基因表达；进一步研究了SIRT6是否参与了MDL-811的抗缺血作用，用MDL-811处理后，虽然SIRT6的表达没有改变，但H3K9和H3K56的乙酰化水平以剂量依赖的方式显着降低。

图6 SIRT6激活剂MDL-811改善tMCAO小鼠的脑缺血损伤和神经炎症。

7.MDL-811促进tMCAO后小鼠的长期功能恢复

为了评估MDL-811在慢性期I/R损伤后减少梗塞和改善神经行为缺陷的作用，在tMCAO后第0、3、7、14、21和28天记录体重变化和神经行为。结果表明MDL-811显着促进了tMCAO小鼠的长期功能恢复并改善了长期神经行为缺陷。

图7 MDL-811促进经受tMCAO的小鼠的长期功能恢复。

8.SIRT6/EZH2/FOXC1通路对于MDL-811抗神经炎症和体内抗缺血至关重要

作者随后检查了SIRT6/EZH2/FOXC1轴在LPS诱导的小鼠神经炎症模型和缺血性中风模型中的作用。EZH2乙酰化和H3K27me3表达显着上调，FOXC1表达在LPS处理的小鼠大脑皮层中下调，这可以被MDL-811逆转。在接受tMCAO的小鼠大脑皮层梗塞周围EZH2乙酰化和H3K27me3表达水平增加，FOXC1表达减少，这可以被MDL-811逆转。这些结果表明SIRT6/EZH2/FOXC1通路可能参与了MDL-811对脑炎症小鼠和缺血性中风小鼠的有益作用。

图8 SIRT6介导的EZH2/FOXC1通路对于MDL-811在LPS诱导的神经炎症小鼠模型和脑缺血性中风小鼠模型中的有益作用至关重要。

9.MDL-811抑制缺血性中风患者原代人单核细胞中LPS诱导的炎症反应

为了进一步证实我们从细胞模型和动物模型中获得的数据的转化相关性，作者在从脑缺血性中风患者分离的外周血单核细胞中进行了LPS诱导的炎症模型。发现各种促炎因子随着MDL-811的治疗而下降，数据显示MDL-811通过使H3K9和H3K56去乙酰化来增加SIRT6活性，过降低H3K27的三甲基化来抑制EZH2的活性，并促进中风患者人单核细胞中FOXC1的表达。发现中风患者血液中的SIRT6 mRNA显着低于健康对照组。此外，作者发现SIRT6基因表达与TNF-a抑制率呈正相关，表明MDL-811治疗可激活SIRT6以抑制中风患者的炎症反应，并在中风患者中表现出更多有益效果SIRT6的表达。

图9 SIRT6激活剂MDL-811抑制缺血性中风患者单核细胞的炎症反应。

作者在这项研究中的发现表明，SIRT6激活剂MDL-811在SIRT6激活引起的脑缺血/再灌注损伤中发挥了良好的抗神经炎症和神经保护作用。从机制上讲，MDL-811通过SIRT6/EZH2/FOXC1信号通路调节神经炎症。作者在本研究中获得的数据可能有助于验证小胶质细胞SIRT6作为一种新的治疗靶点，以及SIRT6激活剂MDL-811在不久的将来治疗缺血性中风的潜在临床用途。