一、研究背景

近年来，研究表明应激诱导的焦虑与杏仁核的持续激活密切相关。而GABA能去抑制是导致这一过程的重要因素，也受到了相当大的关注，许多临床上可用的抗焦虑药和抗抑郁药通过增强杏仁核中的GABA能抑制来发挥作用。杏仁核由十多个亚核组成。其中基底外侧杏仁核（BLA）负责接收和整合来自大脑外部区域的信息，主要由兴奋性投射神经元（PNs，80%-90%）组成。不断积累的研究表明，PN之间在遗传图谱、连接性和功能方面存在相当大的异质性；从BLA → vHPC PNs致焦虑，从BLA→adBNST PNs抗焦虑。鉴于杏仁核中GABA能去抑制在应激相关神经病理中的关键作用，目前尚不清楚应激如何影响这些不同BLA PNs中的GABA能信号，从而导致情绪和行为缺陷。

本研究通过建立慢性社交挫败应激（CSDS）模型，观察慢性应激对基底外侧杏仁核（BLA）内不同投射神经元抑制性电流的影响，并分析了相关的功能意义。结果发现，CSDS下调了BLA内投射至腹侧海马（BLA→vHPC）神经元上由GABAA(δ)R介导的紧张性抑制电流，却上调了投射至前背侧终纹床核神经元的紧张性电流。而CSDS引起的小鼠焦虑样行为增加仅与BLA→vHPC神经元上下调的紧张性抑制电流明显相关。在BLA→vHPC神经元上过表达GABA_A(δ)R可显著缓解应激诱发的焦虑样行为；相反，降低其表达则可模拟慢性应激诱发的焦虑样行为。综上可见，本研究揭示了慢性应激对杏仁核不同神经元紧张性抑制电流的差异化调控机制并阐明了其功能意义，这些发现有望为应激相关精神疾病的防治提供精准的干预靶点。

二、研究结果

1.CSDS反向调节vHPC和BLA中adBNSTPNs的紧张性GABA能抑制

首先测试了CSDS对BLA PNs中多种形式的GABA能抑制的影响（图S1a）。如图S1b–e所示，与非应激对照相比，当电流由GABA、内源性GABAAR配体或其外源性激动剂THIP诱导时，CSDS小鼠的BLA PNs中的紧张电流要弱得多。相反，在sIPSC振幅和频率方面没有观察到组间差异（图S1f-h），或GABABR介导的电流强度（图S1i，j）。因此，这些结果表明CSDS主要通过减弱BLA-PNs中的紧张性抑制来解除对杏仁核的抑制。这种作用在从CSDS无应激恢复2周的应激小鼠中也很明显（图S2），表明CSDS的持续影响。

图S1.

图S2

探索CSDS如何调节分散在不同功能回路中的BLA PNs的抑制。研究选择了BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs证明分别具有抗焦虑和抗焦虑作用。实验程序如图1a所示，将红色和绿色荧光逆转录珠分别注射到adBNST和vHPC中，以区分BLA中的两个群体，这是基于它们胞体中存在的不同荧光（图1b）。这两个种群是混合的，但基本上不重叠（图S3）。我们发现，在未应激的小鼠中，当GABA（图1c，d）或THIP（图1e，f）诱发时，两个群体之间的紧张抑制作用显著不同，BLA→vHPC PN相对于其BLA→adBNST表现显著更强的电流。然而，CSDS对这两个群体的强直电流产生了相反的影响。它显著降低了BLA→vHPC PNs电流，增加了BLA→adBNST PN电流（图1c–f）。CSDS对两个群体中的GABA_AR和GABA_BR电流没有影响（图1g–k）。总之，这些数据有力地表明，CSDS以投射特异性的方式调节BLA PNs中的紧张性GABA_AR电流。

图1

图S3

2.慢性皮质酮治疗模仿CSDS对BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs的相反影响

作者用另一种压力模型重复上述测试，小鼠喂食皮质酮（CORT），持续10天（图S4a）。如图S4所示，类似于CSDS，慢性CORT治疗也降低了BLA→vHPCPNs中THIP诱导的强直电流（图S4b，c），虽然在很大程度上不显着，但增加了BLA→adBNST-PN中的电流强度（图S4d，e）。

因此，两个群体中强直抑制的相反变化可能反映了长期暴露于不同应激源的共同后果。值得注意的是，BLA中强直抑制的CORT调节似乎是性别依赖性的，因为慢性CORT施用未能改变雌性小鼠的强直抑制（图S5）。

图S4

图S5

3.CSDS分别去除并增强BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs的GABA能抑制

鉴于CSDS对BLA中强直GABAAR电流在BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs的相反影响，接下来确定它是否也相反地影响了两个群体的GABA能抑制。将具有逐步增加的强度的去极化电流脉冲递送到记录的细胞中以引起神经元放电，然后研究THIP和PTX的作用。对于BLA→vHPCPNs，THIP显着降低了无应激小鼠的放电次数，并且随后共同施用PTX容易逆转这种效应（图2a，b）。然而，THIP和PTX效应在应激小鼠中被剥夺（图2c）。总之，这些结果强烈表明CSDS容易消除BLA→vHPCPNs活性的GABA能限制。

形成鲜明对比的是，THIP对来自对照小鼠的BLA→adBNST-PN的放电几乎没有影响，但显着降低了它们在CSDS小鼠中的放电（图2d-f）。THIP效应很容易被PTX阻断。这些数据表明在CSDS之后的BLA→adBNSTPNs放电时增强了对强直GABA_AR电流的抑制。因此，与其对强直抑制的对比影响一致，CSDS也相反地调节了两个PN亚群的GABA能抑制。

图2

4.GABAA（δ）R介导CSDS对BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs的相反影响

研究试图确定介导CSDS对两个PN群体影响的GABA_AR。首先使用定量PCR（qPCR）分析来探索CSDS诱导的两个群体中GABA_AR的α3, α5,和δ，3个亚基的mRNA表达的变化（图3a，b）。结果显示，在GABA_AR亚基中，δ亚基作为其mRNA表达受CSDS影响最大的亚基出现。CSDS显着降低其在BLA→vHPCPNs中的mRNA表达（图3c），但增加了在BLA→adBNST-PN中的表达（图3d）。相反，CSD未能显着影响GABA_AR的a3和a5亚基的mRNA表达（图3c，d）。鉴于GABAA（d）R在许多大脑区域介导强直抑制中的确定作用，这些发现提高了它可能作为介导CSDS对两个PN亚群中强直抑制的影响的合理候选受体的可能性。

作者接下来通过探索CSDS对两个群体中GABAA（d）R电流的影响来测试这种可能性。如图3e所示，已知优先激活GABAA（δ）R的低水平THIP，相比于CSDS小鼠，它能引起非应激小鼠的BLA→vHPCPNs中更多电流。相比之下，它在应激小鼠的BLA→adBNSTPNs中产生了比对照组小鼠中更大的电流（图3f）。这些结果揭示了CSDS对两个亚群中GABA_A（δ）R电流的相反调节作用，就像它对δ亚基的mRNA表达一样。在CSDS之后，GABA_A（α3）R和GABA_A（α5）R的电流在两个子集中均不受影响（图S6）。

最后研究了GABA_A（δ）R对两种人群中CSDS对强直抑制作用的影响。为此，作者探讨了CSDS对缺乏GABA_A（δ）R的小鼠的BLA PN的影响（图3g）。GABA_A（δ）R缺失显着下调BLA→vHPCPNs中的强直抑制，但对BLA→adBNSTPNs中的强直抑制几乎没有影响（图S7）。与CSDS对具有完整GABAA（δ）R的两个群体中的强直电流的实质性影响形成鲜明对比的是，CSDS在来自KO小鼠的两个群体中都没有这样做（图3h，i）。总之，这些数据表明GABA_A（δ）R在基于细胞的CSDS对强直抑制的调节中不可或缺的作用。

图3

图S6

图S7

5.BLA→vHPCPNs中强直抑制的消失但不是其在BLA→adBNST PNs中的增加，这与CSDS小鼠焦虑增加相关

作者假设强直抑制在BLA→vHPCPNs中丧失并且其在BLA→adBNSTPNs中的增加，这可能协调促进CSDS诱发的焦虑。首先检查小鼠的焦虑样行为与BLA→vHPC和BLA→adBNST PNs中的强直GABA_AR电流之间是否存在相关性（图4a）。观察到CSDS小鼠表现出比无应激对照更显着的焦虑样行为，这反映在EPM中张开双臂的时间更少，条目更少，OFT中心区域花费的时间更少（图S8在线）。

随后分析小鼠焦虑样行为与强直电流之间的相关性，发现在BLA→vHPCPNs，THIP诱导的强直电流的强度与对照组小鼠和CSDS小鼠的EPM中张开臂或张开臂入口的时间显着相关（图4b，d）。对于CSDS而不是对照组小鼠，在OFT中心区域的电流强度和时间之间也观察到相关性（图4f），表明CSDS可能增强在BLA→vHPCPNs中的强直抑制作用调整焦虑。然而，与我们的预期相反，在两个小鼠组中，在任何行为参数和BLA→adBNST PNs中的强直电流之间没有发现单一相关性（图4c，e，g），反对在这个PN子集中涉及强直抑制。

图4

图S8

作者接下来确定CSDS在两个人群中的相反影响是否与CORT分泌增加有关。如图S9所示，CSDS显着增加小鼠的基础CORT水平（图S9a，b）。相关分析显示，个体小鼠的CORT水平也仅与BLA→vHPC中的强直抑制强度相关但不是BLA→adBNST细胞（图S9c，d）。因此，在以下实验中，探讨BLA PNs中改变的GABA_A（δ）R功能对于CSDS诱导的焦虑样行为增加的必要性和充分性，我们关注BLA→vHPCPNs而不是它们的BLA→adBNST。

图S9

6.在BLA→vHPCPNs中过表达GABA_A（δ）R阻断CSDS诱导的焦虑样行为增加

接下来探索是否预防BLA→vHPCPNs中强直抑制的丧失将防止CSDS逆境。为此，作者使用Cre依赖性病毒介导的方法在BLA→vHPC-PN中过表达与荧光蛋白（Gabrd-EGFP）或EGFP（仅EGFP）融合的GABA_AR的δ亚基（图5a-c）。首先测试了δ亚基过表达在预防CSDS诱导的BLA→vHPCPNs中的强直抑制丧失中的有效性。如图5所示，相对于来自仅EGFP小鼠的BLA→vHPCPNs，来自Gabrd-EGFP小鼠具有更强的强直电流，表明GABA_A（δ）R在BLA→vHPCPNs中过表达导致该群体中强直抑制的增强（图5d-f）。CSDS只会导致来自仅有EGFP的BLA→vHPCPNs中的强直电流损失，而不是Gabrd-EGFP组小鼠的（图5e，f），表明GABA_A（δ）R过表达在预防CSDS诱导的BLA→vHPCPNs中的强直抑制丧失方面的有效性。

然后作者探讨了BLA→vHPCPNs中GABAA（δ）R是否过表达进行行为学测试。首先，仅在OFT（图5g–i）和EPM（图5j–l）中测量，仅EGFP和Gabrd-EGFP小鼠的焦虑样行为没有差异。其次，虽然CSDS明显增加了仅EGFP小鼠的焦虑样行为，但在Gabrd-EGFP小鼠中不明显（图5g-1），表明GABA_A（δ）R在BLA→vHPCPNs过表达可防止CSDS对小鼠焦虑样行为的影响。

图5

7.下调BLA→vHPCPNs中的GABA_A（δ）R表达模拟CSDS对小鼠焦虑样行为的一些逆境

最后，判断是否BLA→vHPCPNs中GABA_A（δ）R功能减退本身足以模拟CSDS对小鼠焦虑样行为的影响。作者下调了非应激小鼠的BLA→vHPCPNs中的GABA_A（δ）R功能通过使用交叉病毒方法在该群体中表达靶向Gabrd mRNA（Gabrd shRNA）或对照shRNA的Cre条件短发夹RNA构建体（图6a-c）。比较感染Gabrd shRNA或对照shRNA的BLA→vHPCPNs中的强直抑制显示Gabrd shRNA的表达显着降低了该群体中GABA_A（δ）R介导的强直抑制（图6d-f）。

然后我们探讨是否在BLA→vHPCPNs中敲低GABA_A（δ）R将模拟CSDS对小鼠焦虑样行为的逆境。如图6所示，对照shRNA-和Gabrd shRNA-处理的小鼠在中心的时间或在OFT中行进的总距离方面没有差异（图6g-i）。但是，Gabrd shRNA小鼠在EPM中花费的时间更少，并且张开双臂的进入次数更少（图6j–l）。因此，似乎减少BLA→vHPCPNs中的GABA_A（δ）R表达足以少部分地增加小鼠中的一些焦虑样行为。

总之，上述发现表明减少GABA_A（δ）R介导的BLA→vHPCPNs中的强直抑制在应激诱导的焦虑样行为增加中起关键作用（图6m）。

图6

三、小结与思考

作者通过体内实验证明，将GABA_A（δ）R鉴定为不同BLA PN群体中慢性应激对强直抑制的相反调节的核心介质，并强调了GABA_A（δ）R功能减退在应激诱导焦虑的BLA→vHPCPNs中的关键作用。鉴于越来越多的证据表明BLA→vHPC途径涉及压力对情绪和行为的有害影响，我们的研究结果以及该途径中突触和神经元活动的相当大的重塑，为参与这一途径在压力逆境中。进一步研究理解GABA_A（δ）R应激相反调节的分子级联可能为杏仁核回路对应激的异质适应提供新的见解。

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